細胞凍存是指將細胞放在低溫環(huán)境，以達到減少細胞代謝的作用，從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的，以供后續(xù)實驗或臨床使用。
目前，細胞凍存主要的技術為液氮冷凍法，實際凍存過程中，需要進行梯度溫度凍存，并加入適量的保護劑以保證細胞內(nèi)外的水分不會形成冰晶造成細胞的損傷或死亡。
在準備冷凍靶細胞之前，必須確保細胞處于最佳生長狀態(tài)，這可以通過以下指標進行觀察：
培養(yǎng)基的顏色可以指示細胞是否過度生長（例如，如果細胞是黃色，則表示它們過度生長）；介質的渾濁度通常表明存在污染，不適合冷凍。
通常，建議將新恢復的細胞冷凍約兩周。如果細胞連續(xù)培養(yǎng)兩個月以上，性狀率會發(fā)生一些變化，此時的細胞不適合冷凍。
在凍存過程中，每只凍存管內(nèi)細胞最佳濃度為5x10^6個/ml—1x10^7個/ml，高密度或低密度對細胞存活率有一定影響。當細胞數(shù)量不足時，不建議冷凍細胞。
在細胞被消化和離心后，去除上清液并收集細胞沉淀，它們通常需要用冷凍保存液再次懸浮并轉移到冷凍保存管中。凍存液中一般含有滲透型的保護液如甘油或10%的二甲基亞砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。
細胞內(nèi)外的主要成分是水。如果細胞在沒有保護溶液的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水會凝結成冰晶，對細胞造成內(nèi)源性的機械損傷。細胞內(nèi)的水凝結引起的細胞脫水也會引起細胞內(nèi)pH值的變化、蛋白質變性、細胞內(nèi)部器官功能的喪失，甚至細胞核內(nèi)的DNA損傷，最終可能導致細胞死亡。
而凍存液往往都是易溶解的小分子物質，具有細胞滲透性，可以穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)，降低冰點，同時又可以提高細胞膜對水的通透性，使得細胞內(nèi)水分滲出到細胞外，從而減少細胞內(nèi)冰晶的形成。
*一些特殊的細胞，如原代皮膚細胞，會額外添加表面保護劑，如海藻糖，以提高細胞存活率。
*由于DMSO對大部分細胞無毒性作用，因此廣泛用于細胞冷凍保存；還有一些細胞，一些細胞對二甲基亞砜的毒性敏感，甘油可以用作冷凍保護劑。
冷凍保存液的另一個主要成分是胎牛血清。由于冷凍保存中的細胞代謝仍然很弱，向冷凍保存液中添加血清可以為細胞提供營養(yǎng)。同時，富含血清的蛋白質和其他大分子物質可以更好地保護細胞。實驗證明，低溫保存液中高比例的血清有利于提高細胞活力。因此，90%的血清加10%的保護液可用于冷凍期間的細胞保存。對于常見的易于培養(yǎng)的細胞系，10%-20%的血清加上一定量的完整培養(yǎng)基和DMSO也能很好地保存細胞。
細胞冷凍保存過程是一個梯度冷卻過程，液氮是細胞最終保存的最佳冷凍介質。液氮的溫度可以低至-196℃。在這種低溫條件下，細胞保存理論上是永久的。
緩慢冷凍過程可以使細胞內(nèi)的水在冷凍前滲出細胞形成冰晶，因此梯度冷卻可以大大減少冷卻過程中對細胞的損傷。目前，實驗室常用的梯度冷卻方法如下：
凍存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小時（或過夜，最長放置時間不要超過一個月）→ 轉移至液氮長期儲存。
*細胞置于4℃及-20℃的時間不可太長，且從4℃轉移至-20℃時，最好顛倒混勻下細胞，防止細胞大量沉降堆積至管底，影響細胞復蘇。
利用介質特性或制冷程序進行獨立梯度冷卻：
將冷凍管放入細胞冷凍箱內(nèi)（冷凍箱內(nèi)需提前預冷至4℃，并檢查箱內(nèi)異丙醇或其他液體是否充足），然后將其置于-80℃冰箱中16-18小時（或過夜，最長儲存時間不應超過一個月）→ 將其轉移到液氮中長期儲存。
將低溫保存管放入低溫鏡中，以1-2℃/min的冷卻速度下降至-100℃→ 將其轉移到液氮中長期儲存
液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮氣，是生命科學研究和醫(yī)藥行業(yè)常用的冷凍儲存介質，具有以下理化性質：
01
超低溫性：液氮的沸點為－195．8，液氮氣化時每公斤可吸熱 48 大卡；
02
無色、無臭、無毒的液體；
03
窒息性：氮氣本身不能致使人窒息，但在一定空間內(nèi)，如果氮氣過多而隔絕氧氣，操作者也會引起窒息。
因而，在操作液氮罐時，需要注意以下安全使用規(guī)范：
防止凍傷。雖然它滲透性很弱，但當人體皮膚接觸液氮時會受到嚴重凍傷。在放置細胞時，一定要確保穿戴了厚手套、護目鏡、實驗服；
盡可能地快速操作。由于液氮在空氣中會迅速吸熱氣化，為了避免樣品溫度變化影響其質量，需盡快操作；
做好維護。定時查看液氮余量，確保罐內(nèi)液體高度沒過重要樣品，最少時，液氮不可少于罐體容積的三分之一。
400-800-6815
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